A chromosome-scale genome of Berberis wilsoniae reveals the evolution and chromosomal organization of benzylisoquinoline alkaloid-related genes金花小檗染色體水平基因組揭示芐基異喹啉生物堿相關(guān)基因的演化與染色體排布特征摘要本研究組裝得到金花小檗Berberis wilsoniae染色體水平基因組為芐基異喹啉生物堿相關(guān)基因研究提供基礎(chǔ)資源。通過(guò)比較基因組學(xué)、生物堿譜以及轉(zhuǎn)錄組分析揭示了該物種譜系特異性的基因重排特征并發(fā)現(xiàn)其小檗堿相關(guān)代謝過(guò)程在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)為開展小檗科與毛茛目植物的特化代謝及進(jìn)化基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1 引言植物次生代謝產(chǎn)物在植物防御、生態(tài)互作以及藥物開發(fā)中發(fā)揮重要作用Upadhyay 等。其中芐基異喹啉生物堿BIA是一類重要特化代謝物廣泛分布于基部真雙子葉植物。該類化合物具有多樣藥理活性包括抗菌、抗炎以及抗腫瘤活性Hagel Facchini。代表性 BIA 類化合物包括小檗堿、嗎啡、可待因、罌粟堿多數(shù)主要由毛茛目植物合成Tian 等。近年來(lái)多種 BIA 合成植物罌粟、黃連、黃檗、千金藤等的高質(zhì)量基因組與多組學(xué)比較數(shù)據(jù)集相繼發(fā)表極大推動(dòng)了人們對(duì) BIA 生物合成及其演化分化的認(rèn)知。已有比較基因組研究表明BIA 代謝能力分散在多個(gè)植物譜系涵蓋毛茛目、無(wú)患子目、Proteales山龍眼目以及木蘭類植物說(shuō)明 BIA 生物合成既存在譜系特異性分化也發(fā)生趨同進(jìn)化Chen 等Liu 等Pei 等Liu 等Liu 等Xu 等Chen 等。目前已經(jīng)解析 BIA 生物合成多條關(guān)鍵酶促步驟包括柯勞靈-N-甲基轉(zhuǎn)移酶CNMT、小檗堿橋酶BBE以及多種 O-甲基轉(zhuǎn)移酶OMT如去甲柯勞靈 6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶6OMT、3′-羥基-N-甲基柯勞靈 4′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶4′OMTFacchini 等Choi 等Chen 等Liu 等Wu 等Shan 等。盡管該通路核心生化反應(yīng)已有較多研究但不同植物類群中這些合成基因的演化模式仍尚不明確。毛茛目屬于真雙子葉植物中較早分化的類群同時(shí)也是 BIA 物質(zhì)最為豐富的植物目之一Xu 等Group 等。該目下罌粟科、毛茛科、小檗科多個(gè)物種均可合成大量具有藥用價(jià)值的 BIA 類化合物Xu 等Aalinezhad 等Muhammad 等。其中小檗屬植物可大量積累原小檗堿型生物堿 —— 小檗堿該物質(zhì)兼具抗菌、抗炎、降血糖、心臟保護(hù)等多種藥理活性Liu 等Fatima Hashmi 等Muhammad 等。雖然小檗屬藥用價(jià)值由來(lái)已久但相較于罌粟、黃連這些模式 BIA 合成植物小檗科基因組資源仍然匱乏。因此小檗屬中 BIA 合成基因的基因組組成、演化歷史、染色體排布模式仍有待解析。為解析毛茛目中 BIA 合成基因的演化規(guī)律本研究選取金花小檗Berberis wilsoniae作為研究對(duì)象開展基因組水平分析。本研究整合 PacBio HiFi、Hi-C 與 Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝獲得金花小檗高質(zhì)量染色體水平參考基因組。結(jié)合比較基因組、轉(zhuǎn)錄組分析與系統(tǒng)發(fā)育重建系統(tǒng)鑒定 BIA 生物合成相關(guān)基因家族解析不同類群中 BIA 相關(guān)基因的復(fù)制模式與基因組排布特征。本研究不僅為金花小檗小檗堿代謝研究提供基因組資源也為理解毛茛目防御型次生代謝通路的演化提供新的比較基因組學(xué)證據(jù)。詳細(xì)材料與方法見支持信息部分。2 結(jié)果與討論2.1 基因組組裝與比較基因組概況為解析金花小檗中小檗堿及其相關(guān) BIA 代謝利用 PacBio HiFi、Hi-C 以及 Illumina 短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)構(gòu)建染色體水平參考基因組。kmer 分析預(yù)估基因組大小約 1.02 Gb雜合度中等重復(fù)序列占比較高提示該基因組復(fù)雜度較高。最終組裝基因組大小 1228.47 Mbcontig N50 為 76.96 Mbscaffold N50 為 87.57 Mb99.16% 組裝序列錨定到 14 條染色體上圖 1。多項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)證明組裝質(zhì)量可靠HiC 互作熱圖顯示清晰的染色體互作模式Illumina 讀段比對(duì)率 99.55%Merqury 評(píng)估一致性質(zhì)量值 QV48.47BUSCO 評(píng)估保守基因完整度 97.5%附圖、附表。重復(fù)序列注釋結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座元件占基因組 44.83%以 LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為主。本研究注釋得到 50 808 個(gè)蛋白編碼基因以及多類非編碼 RNA。以上結(jié)果說(shuō)明金花小檗基因組組裝連續(xù)性與完整度高可作為生物堿合成基因挖掘與比較基因組分析的可靠參考基因組。金花小檗的基因組演化、組織特異性小檗堿積累與轉(zhuǎn)錄組分化A. Circos 圖展示金花小檗基因組的染色體模式圖、轉(zhuǎn)座元件TE密度、簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR密度、基因密度、GC 含量以及基因組內(nèi)共線性區(qū)塊。 B. 韋恩圖展示 5 個(gè)代表性物種金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟、耬斗菜共有及物種特有基因家族。 C. 基于 OrthoFinder 得到的 12 個(gè)代表性被子植物的直系同源基因家族構(gòu)成。 D. 基于嚴(yán)格單拷貝直系同源基因構(gòu)建的物種系統(tǒng)發(fā)育樹、分化時(shí)間以及基因家族擴(kuò)張 / 收縮情況。藍(lán)色條為 95% 最高后驗(yàn)密度區(qū)間分支上數(shù)字代表擴(kuò)張 / 收縮的基因家族數(shù)目。地質(zhì)年代縮寫Jur. 侏羅紀(jì)Cre. 白堊紀(jì)Pal. 古近紀(jì)N. 新近紀(jì)Q. 第四紀(jì)。 E. 利用靶向 LC–MS/MS 定量檢測(cè)根、莖、葉組織中的小檗堿。彩色連線連接同一個(gè)生物學(xué)個(gè)體的不同組織空心圓與誤差棒代表平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)值經(jīng)過(guò)空白校正以組織干重進(jìn)行歸一化并采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸展示。組織間差異采用重復(fù)測(cè)量單因素方差分析檢驗(yàn)。 F. 葉、莖、根轉(zhuǎn)錄組的主成分分析PCAPC1、PC2 分別解釋 79.04% 和 10.7% 的變異。 G. 種內(nèi)與種間共線性基因?qū)Φ耐x替換率Ks分布反映金花小檗的復(fù)制歷史及其與代表性物種間的分化情況。本研究進(jìn)一步對(duì)比金花小檗與其他被子植物的基因組特征。直系同源分析結(jié)果表明金花小檗保留與近緣物種共有的保守基因組框架同時(shí)擁有物種特有的基因組分。在本研究所選取的代表性物種中金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟和耬斗菜共有 10116 個(gè)基因家族圖與此同時(shí)金花小檗存在自身特有的基因家族說(shuō)明其基因組是在共同祖先框架基礎(chǔ)上改造演化而來(lái)而非產(chǎn)生大量全新基因?；趪?yán)格單拷貝直系同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹為解析基因家族動(dòng)態(tài)變化提供演化背景圖。金花小檗基因組一個(gè)顯著特征擴(kuò)張的基因家族數(shù)量遠(yuǎn)多于收縮的基因家族。在分析的 12894 個(gè)基因家族中5793 個(gè)發(fā)生擴(kuò)張633 個(gè)發(fā)生收縮6468 個(gè)保持相對(duì)穩(wěn)定圖。功能富集結(jié)果顯示擴(kuò)張基因家族主要富集于次生代謝、防御相關(guān)過(guò)程、超敏反應(yīng)、傷口應(yīng)答以及細(xì)胞程序性死亡。這些功能類別與 BIA 作為植物防御性化合物的生物學(xué)角色一致說(shuō)明金花小檗基因組在一定程度上受到防御與特化代謝相關(guān)選擇壓力的塑造。Ks 分析也支持上述結(jié)論。共線性基因?qū)Φ耐x替換率分布存在明顯峰值說(shuō)明金花小檗譜系發(fā)生過(guò)顯著的基因復(fù)制事件或復(fù)制基因保留事件圖。與近緣物種的比較還發(fā)現(xiàn)隨著系統(tǒng)發(fā)育距離增加Ks 值隨之升高。綜上結(jié)果表明金花小檗擁有被子植物保守的基因組骨架同時(shí)在防御與次生代謝相關(guān)功能上發(fā)生譜系特異性擴(kuò)張為其生物堿合成能力奠定演化基礎(chǔ)。2.2 組織特異性生物堿積累與轉(zhuǎn)錄組分化為探究金花小檗生物堿積累是否存在組織差異測(cè)定根、莖、葉總生物堿含量并采用靶向 LC–MS/MS 對(duì)小檗堿進(jìn)行定量圖附圖。本研究進(jìn)一步考察該代謝差異是否伴隨全局性轉(zhuǎn)錄組分化。9 個(gè)樣本的 RNA 測(cè)序主成分分析可將根、莖、葉清晰分為三組圖。第一主成分解釋 79.04% 變異第二主成分解釋 10.70% 變異合計(jì)解釋總變異的 89.74%。該結(jié)果說(shuō)明組織類型是本數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組分化的最主要來(lái)源。葉片生物學(xué)重復(fù)聚集緊密重復(fù)性高根樣本也形成穩(wěn)定類群僅一個(gè)重復(fù)沿第二主成分出現(xiàn)輕微偏移莖樣本同樣獨(dú)立分組但離散程度略大。結(jié)果表明三種組織不僅生物堿含量存在差異整體轉(zhuǎn)錄狀態(tài)也顯著不同。代謝組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合數(shù)據(jù)提示根并非單純被動(dòng)儲(chǔ)存生物堿的組織。如果僅生物堿含量高、轉(zhuǎn)錄組無(wú)明顯分化則可解釋為被動(dòng)積累但根同時(shí)具備高生物堿含量和獨(dú)特的基因表達(dá)譜說(shuō)明根是生物堿相關(guān)代謝主動(dòng)分化的主要組織。這不代表全部合成步驟都局限在根內(nèi)也不排除物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。但綜合證據(jù)表明在金花小檗的組織層面生物堿代謝網(wǎng)絡(luò)中根處于核心地位。該結(jié)果為后續(xù)合成基因分析提供重要依據(jù)。根同時(shí)富集生物堿且轉(zhuǎn)錄組特征最突出是挖掘小檗堿及相關(guān) BIA 候選基因最有價(jià)值的組織。與此同時(shí)葉片生物堿含量也相對(duì)較高說(shuō)明該物種的組織特化是數(shù)量差異型而非絕對(duì)的組織特異性?？傮w而言組織層面的結(jié)果建立了清晰的化學(xué)與轉(zhuǎn)錄組差異為候選基因挖掘確定生物學(xué)背景。小檗堿的定量特征與基于紫外檢測(cè)的總生物堿譜并不一致說(shuō)明金花小檗不同組織的生物堿差異并非只是總豐度的變化不同組織中各類 BIA 單體的相對(duì)占比存在區(qū)別。因此靶向小檗堿定量可以更直接地輔助解讀 BIA 候選基因在根中的富集表達(dá)后續(xù)研究可拓展更多 BIA 的廣譜代謝組檢測(cè)完整解析該物種組織特異性生物堿組成。2.3 小檗堿生物合成候選基因?yàn)橥诰蚪鸹ㄐ￠拗袇⑴c小檗堿及其相關(guān) BIA 合成的候選基因篩選根相對(duì)于莖、葉均上調(diào)表達(dá)的基因結(jié)合功能注釋進(jìn)行聯(lián)合分析附圖附表。該策略共篩選得到 10 個(gè)候選基因包含少量核心候選基因以及參與 BIA 通路主要步驟的多個(gè)輔助基因。由于根的總生物堿含量最高相比于在各組織廣泛低表達(dá)的基因根富集高表達(dá)基因更可能參與通路的活性合成過(guò)程。這套候選基因集合建立了組織生物堿積累與前面基因組分析結(jié)果之間的直接關(guān)聯(lián)。所有候選基因中信號(hào)最顯著的是 CNMT 同源基因 f11G026860。在兩組組織比較中該基因均在根中顯著上調(diào)是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中最突出的單一候選基因。CNMT 參與 BIA 通路早期甲基化步驟該基因的重要性與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此 Bwi11G026860 是目前金花小檗中最有可能承擔(dān)關(guān)鍵合成功能的候選基因。該結(jié)果的亮點(diǎn)不僅在于該基因高表達(dá)而是在大量復(fù)制保留的同源基因背景下這一個(gè)拷貝的表達(dá)優(yōu)勢(shì)非常突出。數(shù)據(jù)提示并非所有 CNMT 同源拷貝均等參與代謝而是特定拷貝在生物堿含量最高的組織中優(yōu)先發(fā)揮功能。候選基因集合第二個(gè)顯著特征多個(gè) OMT 同源基因呈現(xiàn)明顯的根偏好表達(dá)。部分 OMT 候選基因在根中高表達(dá)在葉、莖中表達(dá)極低另一些則呈現(xiàn)梯度模式根表達(dá)最高莖中等葉片最低。雖然各個(gè)基因表達(dá)模式細(xì)節(jié)有差異但整體趨勢(shì)一致。BIA 通路的甲基化相關(guān)步驟在根中活性最高。該結(jié)果說(shuō)明根富集型生物堿積累并非依靠單個(gè)基因而是由一組以甲基化功能為核心的表達(dá)模塊共同驅(qū)動(dòng)。同時(shí)不同 OMT 同源基因表達(dá)譜存在差異提示這些保留的基因拷貝之間發(fā)生功能分化而非簡(jiǎn)單的功能冗余。其余候選基因說(shuō)明并非通路所有步驟都同等局限于根。BBE 同源基因與兩個(gè) NCS 同源基因表現(xiàn)為根偏好或根、莖共表達(dá)不像 CNMT 和部分 OMT 基因那樣強(qiáng)烈富集于根。說(shuō)明候選基因至少分為兩類表達(dá)模式一類強(qiáng)根富集與生物堿最高積累組織緊密關(guān)聯(lián)另一類在根、莖均可發(fā)揮功能。該模式具備生物學(xué)合理性部分通路步驟集中在終產(chǎn)物大量積累的組織另一些步驟則可在更多器官中發(fā)揮作用。2.4 BIA 相關(guān)基因的演化保守性與分化為從演化角度解析金花小檗候選基因比較多個(gè)代表性毛茛目物種的主要 BIA 相關(guān)基因家族解析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與染色體分布。BIA 合成酶基因的比較染色體分布與局部基因簇排布見圖擴(kuò)張基因家族功能富集結(jié)果見圖采樣植物代表性形態(tài)特征見圖。結(jié)果表明金花小檗篩選得到的候選基因歸屬于已知 BIA 通路家族并非來(lái)源于更大酶超家族中無(wú)關(guān)分支。說(shuō)明金花小檗小檗堿生物合成依托一套與其他 BIA 合成植物共享的保守催化框架。因此該物種的特殊性大概率不是通路起源本身而是該譜系內(nèi)特定基因家族的保留、擴(kuò)張與表達(dá)模式重塑。對(duì) CNMT、BBE、OMT、CYP80 類蛋白的擴(kuò)大系統(tǒng)發(fā)育分析顯示不同基因家族演化模式并不相同附圖。CNMT 類候選基因保守性最強(qiáng)與已報(bào)道功能 CNMT 基因聚為一支同時(shí)在所有核心候選基因中根富集表達(dá)最強(qiáng)提示該步驟是通路中相對(duì)穩(wěn)定的組成部分。與之相比OMT 家族演化模式更復(fù)雜分化為多個(gè)亞群分別承擔(dān)不同甲基化功能家族內(nèi)部分化程度更高。在 OMT 類家族中金花小檗候選基因分散在 6OMT 和 4′OMT 參考分支附近提示 OMT 功能發(fā)生多樣化。本研究也在金花小檗中鑒定到 CYP80 同源基因部分候選基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上與已表征 CYP80B 蛋白親緣較近但無(wú)法明確判定為 CYP80B1 的直系同源基因。綜上可見BIA 通路部分區(qū)段演化保守另一些區(qū)段在譜系內(nèi)部及譜系之間發(fā)生更大程度分化。染色體分布特征進(jìn)一步印證上述結(jié)論。金花小檗的 BBE 同源基因與 4′OMT 同源基因分布在染色體不同位置沒(méi)有形成明顯局部基因簇而 6OMT 類基因排布更集中9 號(hào)染色體上存在兩個(gè)緊密連鎖的基因提示該家族發(fā)生局部復(fù)制保留。這種差異說(shuō)明同一代謝通路的基因不一定擁有相同基因組排布模式部分家族基因分散分布另一些存在局部擴(kuò)張證據(jù)。這表明金花小檗 BIA 相關(guān)基因的演化并非協(xié)同統(tǒng)一的過(guò)程通路不同步驟的基因發(fā)生差異化變化。BIA 基因家族這種染色體排布差異對(duì)通路演化與調(diào)控具有潛在生物學(xué)意義。金花小檗 BIA 相關(guān)基因并未形成單一緊湊的代謝基因簇而是混合排布模式6OMT 家族存在局部復(fù)制保留BBE 與 4′OMT 基因分散分布。9 號(hào)染色體上兩個(gè) 6OMT 同源基因緊密連鎖可能源于串聯(lián)復(fù)制為甲基化相關(guān)步驟提供拷貝數(shù)增加或局部共調(diào)控的基因組基礎(chǔ)。與之相對(duì)BBE 與 4′OMT 基因分散排布提示通路其余步驟更可能依靠反式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控協(xié)同而非依靠物理成簇。結(jié)合只有部分 BIA 候選基因根富集表達(dá)的特征說(shuō)明金花小檗小檗堿合成由兩類機(jī)制共同塑造特定基因家族的局部串聯(lián)復(fù)制以及物理上分散的通路基因的組織特異性調(diào)控?？缥锓N比較進(jìn)一步印證該結(jié)論。金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟之間BBE、4′OMT、6OMT 基因的拷貝數(shù)與基因組排布各不相同。部分物種存在成簇拷貝另一些僅保留少數(shù)分散拷貝不同家族擴(kuò)張程度也存在差異。結(jié)果提示近緣物種可以擁有相同的核心生化通路但支撐通路的基因在基因組上的排布方式差異巨大。總體而言系統(tǒng)發(fā)育與比較基因組證據(jù)表明金花小檗小檗堿相關(guān)代謝是保守性與分化性的結(jié)合體。核心酶促框架與其他 BIA 合成類群共享但特定基因家族的拷貝數(shù)、染色體排布與表達(dá)模式發(fā)生譜系特異性重塑。結(jié)合基因組、組織化學(xué)與表達(dá)分析結(jié)果證明金花小檗 BIA 生物合成是在祖先共有代謝框架基礎(chǔ)上改造形成并非從頭誕生全新通路。Data Availability StatementAll raw sequence data have been deposited in the National Genomics Data Center (NGDC;BioProject - CNCB-NGDC) under BioProject accession number PRJCA060092 and GSA accession number CRA040064. The genome assembly and annotation files are available in ScienceDB atChromosome-level genome of Berberis wilsoniae. 金花小檗基因組--Journal of Systematics and Evolution
A chromosome-scale genome of Berberis wilsoniae reveals the evolution and chromosomal organization of benzylisoquinoline alkaloid-related genes金花小檗染色體水平基因組揭示芐基異喹啉生物堿相關(guān)基因的演化與染色體排布特征摘要本研究組裝得到金花小檗Berberis wilsoniae染色體水平基因組為芐基異喹啉生物堿相關(guān)基因研究提供基礎(chǔ)資源。通過(guò)比較基因組學(xué)、生物堿譜以及轉(zhuǎn)錄組分析揭示了該物種譜系特異性的基因重排特征并發(fā)現(xiàn)其小檗堿相關(guān)代謝過(guò)程在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)為開展小檗科與毛茛目植物的特化代謝及進(jìn)化基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1 引言植物次生代謝產(chǎn)物在植物防御、生態(tài)互作以及藥物開發(fā)中發(fā)揮重要作用Upadhyay 等。其中芐基異喹啉生物堿BIA是一類重要特化代謝物廣泛分布于基部真雙子葉植物。該類化合物具有多樣藥理活性包括抗菌、抗炎以及抗腫瘤活性Hagel Facchini。代表性 BIA 類化合物包括小檗堿、嗎啡、可待因、罌粟堿多數(shù)主要由毛茛目植物合成Tian 等。近年來(lái)多種 BIA 合成植物罌粟、黃連、黃檗、千金藤等的高質(zhì)量基因組與多組學(xué)比較數(shù)據(jù)集相繼發(fā)表極大推動(dòng)了人們對(duì) BIA 生物合成及其演化分化的認(rèn)知。已有比較基因組研究表明BIA 代謝能力分散在多個(gè)植物譜系涵蓋毛茛目、無(wú)患子目、Proteales山龍眼目以及木蘭類植物說(shuō)明 BIA 生物合成既存在譜系特異性分化也發(fā)生趨同進(jìn)化Chen 等Liu 等Pei 等Liu 等Liu 等Xu 等Chen 等。目前已經(jīng)解析 BIA 生物合成多條關(guān)鍵酶促步驟包括柯勞靈-N-甲基轉(zhuǎn)移酶CNMT、小檗堿橋酶BBE以及多種 O-甲基轉(zhuǎn)移酶OMT如去甲柯勞靈 6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶6OMT、3′-羥基-N-甲基柯勞靈 4′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶4′OMTFacchini 等Choi 等Chen 等Liu 等Wu 等Shan 等。盡管該通路核心生化反應(yīng)已有較多研究但不同植物類群中這些合成基因的演化模式仍尚不明確。毛茛目屬于真雙子葉植物中較早分化的類群同時(shí)也是 BIA 物質(zhì)最為豐富的植物目之一Xu 等Group 等。該目下罌粟科、毛茛科、小檗科多個(gè)物種均可合成大量具有藥用價(jià)值的 BIA 類化合物Xu 等Aalinezhad 等Muhammad 等。其中小檗屬植物可大量積累原小檗堿型生物堿 —— 小檗堿該物質(zhì)兼具抗菌、抗炎、降血糖、心臟保護(hù)等多種藥理活性Liu 等Fatima Hashmi 等Muhammad 等。雖然小檗屬藥用價(jià)值由來(lái)已久但相較于罌粟、黃連這些模式 BIA 合成植物小檗科基因組資源仍然匱乏。因此小檗屬中 BIA 合成基因的基因組組成、演化歷史、染色體排布模式仍有待解析。為解析毛茛目中 BIA 合成基因的演化規(guī)律本研究選取金花小檗Berberis wilsoniae作為研究對(duì)象開展基因組水平分析。本研究整合 PacBio HiFi、Hi-C 與 Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝獲得金花小檗高質(zhì)量染色體水平參考基因組。結(jié)合比較基因組、轉(zhuǎn)錄組分析與系統(tǒng)發(fā)育重建系統(tǒng)鑒定 BIA 生物合成相關(guān)基因家族解析不同類群中 BIA 相關(guān)基因的復(fù)制模式與基因組排布特征。本研究不僅為金花小檗小檗堿代謝研究提供基因組資源也為理解毛茛目防御型次生代謝通路的演化提供新的比較基因組學(xué)證據(jù)。詳細(xì)材料與方法見支持信息部分。2 結(jié)果與討論2.1 基因組組裝與比較基因組概況為解析金花小檗中小檗堿及其相關(guān) BIA 代謝利用 PacBio HiFi、Hi-C 以及 Illumina 短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)構(gòu)建染色體水平參考基因組。kmer 分析預(yù)估基因組大小約 1.02 Gb雜合度中等重復(fù)序列占比較高提示該基因組復(fù)雜度較高。最終組裝基因組大小 1228.47 Mbcontig N50 為 76.96 Mbscaffold N50 為 87.57 Mb99.16% 組裝序列錨定到 14 條染色體上圖 1。多項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)證明組裝質(zhì)量可靠HiC 互作熱圖顯示清晰的染色體互作模式Illumina 讀段比對(duì)率 99.55%Merqury 評(píng)估一致性質(zhì)量值 QV48.47BUSCO 評(píng)估保守基因完整度 97.5%附圖、附表。重復(fù)序列注釋結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座元件占基因組 44.83%以 LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為主。本研究注釋得到 50 808 個(gè)蛋白編碼基因以及多類非編碼 RNA。以上結(jié)果說(shuō)明金花小檗基因組組裝連續(xù)性與完整度高可作為生物堿合成基因挖掘與比較基因組分析的可靠參考基因組。金花小檗的基因組演化、組織特異性小檗堿積累與轉(zhuǎn)錄組分化A. Circos 圖展示金花小檗基因組的染色體模式圖、轉(zhuǎn)座元件TE密度、簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR密度、基因密度、GC 含量以及基因組內(nèi)共線性區(qū)塊。 B. 韋恩圖展示 5 個(gè)代表性物種金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟、耬斗菜共有及物種特有基因家族。 C. 基于 OrthoFinder 得到的 12 個(gè)代表性被子植物的直系同源基因家族構(gòu)成。 D. 基于嚴(yán)格單拷貝直系同源基因構(gòu)建的物種系統(tǒng)發(fā)育樹、分化時(shí)間以及基因家族擴(kuò)張 / 收縮情況。藍(lán)色條為 95% 最高后驗(yàn)密度區(qū)間分支上數(shù)字代表擴(kuò)張 / 收縮的基因家族數(shù)目。地質(zhì)年代縮寫Jur. 侏羅紀(jì)Cre. 白堊紀(jì)Pal. 古近紀(jì)N. 新近紀(jì)Q. 第四紀(jì)。 E. 利用靶向 LC–MS/MS 定量檢測(cè)根、莖、葉組織中的小檗堿。彩色連線連接同一個(gè)生物學(xué)個(gè)體的不同組織空心圓與誤差棒代表平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)值經(jīng)過(guò)空白校正以組織干重進(jìn)行歸一化并采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸展示。組織間差異采用重復(fù)測(cè)量單因素方差分析檢驗(yàn)。 F. 葉、莖、根轉(zhuǎn)錄組的主成分分析PCAPC1、PC2 分別解釋 79.04% 和 10.7% 的變異。 G. 種內(nèi)與種間共線性基因?qū)Φ耐x替換率Ks分布反映金花小檗的復(fù)制歷史及其與代表性物種間的分化情況。本研究進(jìn)一步對(duì)比金花小檗與其他被子植物的基因組特征。直系同源分析結(jié)果表明金花小檗保留與近緣物種共有的保守基因組框架同時(shí)擁有物種特有的基因組分。在本研究所選取的代表性物種中金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟和耬斗菜共有 10116 個(gè)基因家族圖與此同時(shí)金花小檗存在自身特有的基因家族說(shuō)明其基因組是在共同祖先框架基礎(chǔ)上改造演化而來(lái)而非產(chǎn)生大量全新基因?；趪?yán)格單拷貝直系同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹為解析基因家族動(dòng)態(tài)變化提供演化背景圖。金花小檗基因組一個(gè)顯著特征擴(kuò)張的基因家族數(shù)量遠(yuǎn)多于收縮的基因家族。在分析的 12894 個(gè)基因家族中5793 個(gè)發(fā)生擴(kuò)張633 個(gè)發(fā)生收縮6468 個(gè)保持相對(duì)穩(wěn)定圖。功能富集結(jié)果顯示擴(kuò)張基因家族主要富集于次生代謝、防御相關(guān)過(guò)程、超敏反應(yīng)、傷口應(yīng)答以及細(xì)胞程序性死亡。這些功能類別與 BIA 作為植物防御性化合物的生物學(xué)角色一致說(shuō)明金花小檗基因組在一定程度上受到防御與特化代謝相關(guān)選擇壓力的塑造。Ks 分析也支持上述結(jié)論。共線性基因?qū)Φ耐x替換率分布存在明顯峰值說(shuō)明金花小檗譜系發(fā)生過(guò)顯著的基因復(fù)制事件或復(fù)制基因保留事件圖。與近緣物種的比較還發(fā)現(xiàn)隨著系統(tǒng)發(fā)育距離增加Ks 值隨之升高。綜上結(jié)果表明金花小檗擁有被子植物保守的基因組骨架同時(shí)在防御與次生代謝相關(guān)功能上發(fā)生譜系特異性擴(kuò)張為其生物堿合成能力奠定演化基礎(chǔ)。2.2 組織特異性生物堿積累與轉(zhuǎn)錄組分化為探究金花小檗生物堿積累是否存在組織差異測(cè)定根、莖、葉總生物堿含量并采用靶向 LC–MS/MS 對(duì)小檗堿進(jìn)行定量圖附圖。本研究進(jìn)一步考察該代謝差異是否伴隨全局性轉(zhuǎn)錄組分化。9 個(gè)樣本的 RNA 測(cè)序主成分分析可將根、莖、葉清晰分為三組圖。第一主成分解釋 79.04% 變異第二主成分解釋 10.70% 變異合計(jì)解釋總變異的 89.74%。該結(jié)果說(shuō)明組織類型是本數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組分化的最主要來(lái)源。葉片生物學(xué)重復(fù)聚集緊密重復(fù)性高根樣本也形成穩(wěn)定類群僅一個(gè)重復(fù)沿第二主成分出現(xiàn)輕微偏移莖樣本同樣獨(dú)立分組但離散程度略大。結(jié)果表明三種組織不僅生物堿含量存在差異整體轉(zhuǎn)錄狀態(tài)也顯著不同。代謝組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合數(shù)據(jù)提示根并非單純被動(dòng)儲(chǔ)存生物堿的組織。如果僅生物堿含量高、轉(zhuǎn)錄組無(wú)明顯分化則可解釋為被動(dòng)積累但根同時(shí)具備高生物堿含量和獨(dú)特的基因表達(dá)譜說(shuō)明根是生物堿相關(guān)代謝主動(dòng)分化的主要組織。這不代表全部合成步驟都局限在根內(nèi)也不排除物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。但綜合證據(jù)表明在金花小檗的組織層面生物堿代謝網(wǎng)絡(luò)中根處于核心地位。該結(jié)果為后續(xù)合成基因分析提供重要依據(jù)。根同時(shí)富集生物堿且轉(zhuǎn)錄組特征最突出是挖掘小檗堿及相關(guān) BIA 候選基因最有價(jià)值的組織。與此同時(shí)葉片生物堿含量也相對(duì)較高說(shuō)明該物種的組織特化是數(shù)量差異型而非絕對(duì)的組織特異性?？傮w而言組織層面的結(jié)果建立了清晰的化學(xué)與轉(zhuǎn)錄組差異為候選基因挖掘確定生物學(xué)背景。小檗堿的定量特征與基于紫外檢測(cè)的總生物堿譜并不一致說(shuō)明金花小檗不同組織的生物堿差異并非只是總豐度的變化不同組織中各類 BIA 單體的相對(duì)占比存在區(qū)別。因此靶向小檗堿定量可以更直接地輔助解讀 BIA 候選基因在根中的富集表達(dá)后續(xù)研究可拓展更多 BIA 的廣譜代謝組檢測(cè)完整解析該物種組織特異性生物堿組成。2.3 小檗堿生物合成候選基因?yàn)橥诰蚪鸹ㄐ￠拗袇⑴c小檗堿及其相關(guān) BIA 合成的候選基因篩選根相對(duì)于莖、葉均上調(diào)表達(dá)的基因結(jié)合功能注釋進(jìn)行聯(lián)合分析附圖附表。該策略共篩選得到 10 個(gè)候選基因包含少量核心候選基因以及參與 BIA 通路主要步驟的多個(gè)輔助基因。由于根的總生物堿含量最高相比于在各組織廣泛低表達(dá)的基因根富集高表達(dá)基因更可能參與通路的活性合成過(guò)程。這套候選基因集合建立了組織生物堿積累與前面基因組分析結(jié)果之間的直接關(guān)聯(lián)。所有候選基因中信號(hào)最顯著的是 CNMT 同源基因 f11G026860。在兩組組織比較中該基因均在根中顯著上調(diào)是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中最突出的單一候選基因。CNMT 參與 BIA 通路早期甲基化步驟該基因的重要性與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此 Bwi11G026860 是目前金花小檗中最有可能承擔(dān)關(guān)鍵合成功能的候選基因。該結(jié)果的亮點(diǎn)不僅在于該基因高表達(dá)而是在大量復(fù)制保留的同源基因背景下這一個(gè)拷貝的表達(dá)優(yōu)勢(shì)非常突出。數(shù)據(jù)提示并非所有 CNMT 同源拷貝均等參與代謝而是特定拷貝在生物堿含量最高的組織中優(yōu)先發(fā)揮功能。候選基因集合第二個(gè)顯著特征多個(gè) OMT 同源基因呈現(xiàn)明顯的根偏好表達(dá)。部分 OMT 候選基因在根中高表達(dá)在葉、莖中表達(dá)極低另一些則呈現(xiàn)梯度模式根表達(dá)最高莖中等葉片最低。雖然各個(gè)基因表達(dá)模式細(xì)節(jié)有差異但整體趨勢(shì)一致。BIA 通路的甲基化相關(guān)步驟在根中活性最高。該結(jié)果說(shuō)明根富集型生物堿積累并非依靠單個(gè)基因而是由一組以甲基化功能為核心的表達(dá)模塊共同驅(qū)動(dòng)。同時(shí)不同 OMT 同源基因表達(dá)譜存在差異提示這些保留的基因拷貝之間發(fā)生功能分化而非簡(jiǎn)單的功能冗余。其余候選基因說(shuō)明并非通路所有步驟都同等局限于根。BBE 同源基因與兩個(gè) NCS 同源基因表現(xiàn)為根偏好或根、莖共表達(dá)不像 CNMT 和部分 OMT 基因那樣強(qiáng)烈富集于根。說(shuō)明候選基因至少分為兩類表達(dá)模式一類強(qiáng)根富集與生物堿最高積累組織緊密關(guān)聯(lián)另一類在根、莖均可發(fā)揮功能。該模式具備生物學(xué)合理性部分通路步驟集中在終產(chǎn)物大量積累的組織另一些步驟則可在更多器官中發(fā)揮作用。2.4 BIA 相關(guān)基因的演化保守性與分化為從演化角度解析金花小檗候選基因比較多個(gè)代表性毛茛目物種的主要 BIA 相關(guān)基因家族解析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與染色體分布。BIA 合成酶基因的比較染色體分布與局部基因簇排布見圖擴(kuò)張基因家族功能富集結(jié)果見圖采樣植物代表性形態(tài)特征見圖。結(jié)果表明金花小檗篩選得到的候選基因歸屬于已知 BIA 通路家族并非來(lái)源于更大酶超家族中無(wú)關(guān)分支。說(shuō)明金花小檗小檗堿生物合成依托一套與其他 BIA 合成植物共享的保守催化框架。因此該物種的特殊性大概率不是通路起源本身而是該譜系內(nèi)特定基因家族的保留、擴(kuò)張與表達(dá)模式重塑。對(duì) CNMT、BBE、OMT、CYP80 類蛋白的擴(kuò)大系統(tǒng)發(fā)育分析顯示不同基因家族演化模式并不相同附圖。CNMT 類候選基因保守性最強(qiáng)與已報(bào)道功能 CNMT 基因聚為一支同時(shí)在所有核心候選基因中根富集表達(dá)最強(qiáng)提示該步驟是通路中相對(duì)穩(wěn)定的組成部分。與之相比OMT 家族演化模式更復(fù)雜分化為多個(gè)亞群分別承擔(dān)不同甲基化功能家族內(nèi)部分化程度更高。在 OMT 類家族中金花小檗候選基因分散在 6OMT 和 4′OMT 參考分支附近提示 OMT 功能發(fā)生多樣化。本研究也在金花小檗中鑒定到 CYP80 同源基因部分候選基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上與已表征 CYP80B 蛋白親緣較近但無(wú)法明確判定為 CYP80B1 的直系同源基因。綜上可見BIA 通路部分區(qū)段演化保守另一些區(qū)段在譜系內(nèi)部及譜系之間發(fā)生更大程度分化。染色體分布特征進(jìn)一步印證上述結(jié)論。金花小檗的 BBE 同源基因與 4′OMT 同源基因分布在染色體不同位置沒(méi)有形成明顯局部基因簇而 6OMT 類基因排布更集中9 號(hào)染色體上存在兩個(gè)緊密連鎖的基因提示該家族發(fā)生局部復(fù)制保留。這種差異說(shuō)明同一代謝通路的基因不一定擁有相同基因組排布模式部分家族基因分散分布另一些存在局部擴(kuò)張證據(jù)。這表明金花小檗 BIA 相關(guān)基因的演化并非協(xié)同統(tǒng)一的過(guò)程通路不同步驟的基因發(fā)生差異化變化。BIA 基因家族這種染色體排布差異對(duì)通路演化與調(diào)控具有潛在生物學(xué)意義。金花小檗 BIA 相關(guān)基因并未形成單一緊湊的代謝基因簇而是混合排布模式6OMT 家族存在局部復(fù)制保留BBE 與 4′OMT 基因分散分布。9 號(hào)染色體上兩個(gè) 6OMT 同源基因緊密連鎖可能源于串聯(lián)復(fù)制為甲基化相關(guān)步驟提供拷貝數(shù)增加或局部共調(diào)控的基因組基礎(chǔ)。與之相對(duì)BBE 與 4′OMT 基因分散排布提示通路其余步驟更可能依靠反式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控協(xié)同而非依靠物理成簇。結(jié)合只有部分 BIA 候選基因根富集表達(dá)的特征說(shuō)明金花小檗小檗堿合成由兩類機(jī)制共同塑造特定基因家族的局部串聯(lián)復(fù)制以及物理上分散的通路基因的組織特異性調(diào)控?？缥锓N比較進(jìn)一步印證該結(jié)論。金花小檗、淫羊藿、黃連、罌粟之間BBE、4′OMT、6OMT 基因的拷貝數(shù)與基因組排布各不相同。部分物種存在成簇拷貝另一些僅保留少數(shù)分散拷貝不同家族擴(kuò)張程度也存在差異。結(jié)果提示近緣物種可以擁有相同的核心生化通路但支撐通路的基因在基因組上的排布方式差異巨大。總體而言系統(tǒng)發(fā)育與比較基因組證據(jù)表明金花小檗小檗堿相關(guān)代謝是保守性與分化性的結(jié)合體。核心酶促框架與其他 BIA 合成類群共享但特定基因家族的拷貝數(shù)、染色體排布與表達(dá)模式發(fā)生譜系特異性重塑。結(jié)合基因組、組織化學(xué)與表達(dá)分析結(jié)果證明金花小檗 BIA 生物合成是在祖先共有代謝框架基礎(chǔ)上改造形成并非從頭誕生全新通路。Data Availability StatementAll raw sequence data have been deposited in the National Genomics Data Center (NGDC;BioProject - CNCB-NGDC) under BioProject accession number PRJCA060092 and GSA accession number CRA040064. The genome assembly and annotation files are available in ScienceDB atChromosome-level genome of Berberis wilsoniae.