做神經(jīng)科學(xué)研究的人對(duì)α-Bungarotoxin這個(gè)名字應(yīng)該不會(huì)陌生。它是從銀環(huán)蛇毒液中分離出的一種小分子蛋白毒素能高特異性地結(jié)合煙堿型乙酰膽堿受體nAChR在研究神經(jīng)肌肉接頭、受體聚集和定量分析時(shí)是繞不開(kāi)的工具分子。但有個(gè)很現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題裸的毒素分子在顯微鏡下看不見(jiàn)。于是人們給它接上熒光基團(tuán)讓這個(gè)“定位神器”同時(shí)具備可視化能力AF350標(biāo)記的α-銀環(huán)蛇毒素AF350-α-Bungarotoxin就是其中最常用的商品化探針之一。這篇文章主要面向做神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生理學(xué)研究的同行特別是需要檢測(cè)nAChR分布、追蹤受體聚集或定量細(xì)胞膜表面受體密度的人。不管你在做神經(jīng)肌肉突觸發(fā)育還是在研究α7型受體參與的調(diào)節(jié)機(jī)制后面關(guān)于結(jié)合原理、染色流程、對(duì)照設(shè)計(jì)和踩坑經(jīng)驗(yàn)的展開(kāi)應(yīng)該都能直接幫到你。1. 項(xiàng)目定位AF350-α-Bungarotoxin是什么解決什么問(wèn)題1.1 α-Bungarotoxin一個(gè)被低估的“配體級(jí)”工具分子α-Bungarotoxin是眼鏡蛇科銀環(huán)蛇毒液中的主要神經(jīng)毒素之一屬于典型的“三指毒素”家族。分子量約8 kDa由74個(gè)氨基酸殘基組成空間上像三根并排的手指一樣延伸出來(lái)。它最出名的能力就是與煙堿型乙酰膽堿受體nAChR的α亞基發(fā)生結(jié)合。對(duì)肌肉型受體而言解離常數(shù)可以低到亞納摩爾甚至皮摩爾級(jí)別哪怕是親和力弱一些的α7同源五聚體結(jié)合的緊密程度也遠(yuǎn)超大多數(shù)抗體。正因?yàn)榻Y(jié)合速度夠快、解離極慢α-Bungarotoxin在英文文獻(xiàn)里經(jīng)常被描述為practically irreversible binding。這張“強(qiáng)力膠”一樣的性質(zhì)在實(shí)際操作中意味著你孵育完、洗干凈之后信號(hào)不會(huì)自己掉下來(lái)后續(xù)的洗滌、固定、甚至長(zhǎng)時(shí)間觀察都不會(huì)明顯丟失標(biāo)記。對(duì)做定量實(shí)驗(yàn)的人來(lái)說(shuō)這是非常寶貴的性質(zhì)因?yàn)樗ＷC了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)讀出的信號(hào)都代表孵育那一刻的受體分布狀態(tài)。我見(jiàn)過(guò)不少人第一次用這個(gè)東西時(shí)有一個(gè)誤區(qū)總覺(jué)得抗體更特異天然毒素只能算個(gè)配體。實(shí)際上對(duì)于nAChR這類膜受體α-Bungarotoxin結(jié)合的是受體胞外結(jié)構(gòu)域中的經(jīng)典正構(gòu)配體結(jié)合口袋它標(biāo)記的恰好是受體處于“可結(jié)合配體”的功能狀態(tài)而抗體結(jié)合的表位可能在任意位置不一定反映受體的活性構(gòu)象。所以在很多實(shí)驗(yàn)中毒素探針提供的信息比抗體更能說(shuō)明問(wèn)題。1.2 為什么要在毒素上接一個(gè)AF350AF350全稱是Alexa Fluor 350是Alexa染料家族里偏紫外激發(fā)的藍(lán)色熒光染料激發(fā)峰大約在346 nm發(fā)射峰在442 nm附近。把這樣一個(gè)熒光基團(tuán)偶聯(lián)到α-Bungarotoxin上之后原本“看不見(jiàn)”的配體分子就變成了一個(gè)熒光探針?biāo)廊槐Ａ魧?duì)nAChR的高親和力同時(shí)把結(jié)合位置、數(shù)量和動(dòng)態(tài)變化轉(zhuǎn)化為顯微鏡下可采集的光學(xué)信號(hào)。選擇AF350而不是更流行的綠色或紅色熒光有幾個(gè)很實(shí)際的理由。首先很多神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)本來(lái)就帶著GFP和RFP這類熒光蛋白構(gòu)建體想追蹤多個(gè)分子時(shí)綠色和紅色通道往往已經(jīng)占滿這時(shí)一個(gè)藍(lán)色通道的探針就能在同一個(gè)視野里實(shí)現(xiàn)三色成像不同通道之間的光譜串?dāng)_很小。其次部分組織標(biāo)本在橙紅色區(qū)域的自發(fā)熒光很強(qiáng)但藍(lán)色激發(fā)光的自發(fā)熒光相對(duì)容易控制在做好對(duì)照的前提下信號(hào)更干凈。當(dāng)然藍(lán)色熒光也有自己的短板。紫外波段激發(fā)光能量高光漂白和光毒性都比較明顯普通DAPI濾塊雖然能采集到AF350的信號(hào)但波長(zhǎng)窗口和細(xì)胞核染料的發(fā)射譜重疊。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要把這些考慮進(jìn)去后面我會(huì)專門說(shuō)多色搭配的問(wèn)題。2. 分子的核心原理結(jié)合、標(biāo)記與活性保持2.1 受體結(jié)合位點(diǎn)的分子邏輯與“不可逆”結(jié)合要理解這個(gè)探針為什么這么好用得先看看它結(jié)合在哪兒。肌肉型nAChR是一個(gè)由2個(gè)α亞基和β、δ、γ或成年型的ε組成的五聚體受體兩個(gè)α亞基分別參與形成兩個(gè)正構(gòu)配體結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)位于α-δ界面一個(gè)位于α-γ或α-ε界面。α-Bungarotoxin的三根“手指”會(huì)插進(jìn)這個(gè)結(jié)合口袋里通過(guò)多個(gè)氫鍵和疏水相互作用把受體表面牢牢“按住”。為什么解離這么慢這跟毒素分子本身的構(gòu)象剛性和結(jié)合表面積有關(guān)。三指結(jié)構(gòu)展開(kāi)后覆蓋的氨基酸殘基數(shù)量相當(dāng)多和受體形成的接觸面積大而多對(duì)非共價(jià)鍵同時(shí)維系意味著要讓它們逐個(gè)斷開(kāi)是很困難的。所以哪怕后續(xù)用大量緩沖液沖洗也幾乎不能把已經(jīng)結(jié)合的毒素洗下來(lái)。實(shí)際操作中如果發(fā)現(xiàn)洗完之后信號(hào)反而更干凈多半是洗掉的是非特異吸附真正特異結(jié)合的部分穩(wěn)穩(wěn)留在原處。有讀者可能會(huì)追問(wèn)那這個(gè)探針結(jié)合過(guò)之后會(huì)不會(huì)抑制受體本身的天然功能會(huì)而且這正是它的另一個(gè)用途。α-Bungarotoxin本身就常被用作nAChR的功能阻斷劑在電生理或藥理實(shí)驗(yàn)中合適濃度下可以特異性地阻斷受體通道。在染色實(shí)驗(yàn)中我們用量很低不追求阻斷效果但這個(gè)特性從側(cè)面說(shuō)明它結(jié)合的確實(shí)是功能相關(guān)的正構(gòu)位點(diǎn)。2.2 AF350偶聯(lián)的化學(xué)原理與標(biāo)記率AF350這類熒光染料偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上用的通常是NHS酯琥珀酰亞胺酯化學(xué)。產(chǎn)物中帶活化酯基團(tuán)的AF350會(huì)和蛋白質(zhì)表面的伯胺基團(tuán)發(fā)生酰化反應(yīng)主要是賴氨酸殘基的ε-氨基也包括蛋白N端的α-氨基。α-Bungarotoxin分子表面分布著若干賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物并不是每個(gè)分子都偶聯(lián)了相同數(shù)量的染料而是一個(gè)分布有的毒素分子掛了1個(gè)AF350有的掛了3個(gè)、5個(gè)平均標(biāo)記率通常用F/P比值表示。這里有一個(gè)很關(guān)鍵的平衡標(biāo)記率太低熒光信號(hào)弱標(biāo)記率太高也不一定是好事。因?yàn)锳F350分子雖然不大但大量染料堆在蛋白表面一來(lái)染料之間會(huì)發(fā)生自淬滅二來(lái)偶聯(lián)位點(diǎn)如果恰好靠近受體結(jié)合界面可能產(chǎn)生空間位阻讓毒素結(jié)合nAChR的能力下降。商品化產(chǎn)品通常會(huì)把F/P控制在2~5之間用戶拿到手不需要自己偶聯(lián)但了解這個(gè)機(jī)制對(duì)判斷批間差異很有幫助。我遇到過(guò)一種情況同一個(gè)產(chǎn)品換了一個(gè)批次后染色亮度明顯下降怎么排查都查不到細(xì)胞問(wèn)題最后查看COA才發(fā)現(xiàn)新批次的F/P比從4掉到了2左右。所以做定量比較實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量用同一批次的產(chǎn)品如果必須換批次最好重新做一個(gè)濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)別照搬原來(lái)的工作濃度。2.3 為什么這套標(biāo)記方案能在活細(xì)胞上使用一個(gè)重要且容易被忽略的點(diǎn)活細(xì)胞染色要求探針本身對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性、不會(huì)誘發(fā)劇烈的內(nèi)吞或干擾受體功能。α-Bungarotoxin在實(shí)驗(yàn)用量下通常1~10 μg/mL并不會(huì)引起細(xì)胞明顯死亡而且它分子小不像某些抗體那樣會(huì)通過(guò)交聯(lián)受體而顯著觸發(fā)內(nèi)吞只要孵育時(shí)間控制在合理范圍內(nèi)膜表面受體仍然保持在原位。AF350本身水溶性好偶聯(lián)物在生理緩沖液中不易聚沉這也保證了活細(xì)胞染色時(shí)背景相對(duì)干凈。需要明確的是AF350不是鈣指示劑或膜電位染料它偶聯(lián)到毒素之后只報(bào)告nAChR的位置不會(huì)因?yàn)槟る娢换螂x子濃度變化而改變熒光強(qiáng)度。所以它適合做靜態(tài)分布、半定量評(píng)估如果想要高速追蹤受體在膜上的側(cè)向運(yùn)動(dòng)對(duì)顯微鏡的靈敏度和采集速度會(huì)提出更高要求。3. 實(shí)操全流程從染色到成像的完整方案3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與濃度計(jì)算做實(shí)驗(yàn)前先把材料備齊。除了AF350-α-Bungarotoxin探針本身還建議準(zhǔn)備含鈣鎂的PBS或HBSS活細(xì)胞染色用、無(wú)血清培養(yǎng)基、4% PFA固定液、未標(biāo)記的α-Bungarotoxin做競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照必備、封閉液1%~5% BSA以及滲透液如果染胞內(nèi)抗原。拿到商品化探針先看說(shuō)明書(shū)確認(rèn)濃度。多數(shù)產(chǎn)品提供1 mg/mL左右的溶液分裝后-20℃避光保存。α-Bungarotoxin的分子量約8 kDa所以1 mg/mL約等于125 μM。染色工作濃度一般從100 nM左右開(kāi)始也就是把儲(chǔ)備液稀釋1000倍以上到約1 μg/mL。不同細(xì)胞系和受體亞型表達(dá)水平差異很大建議第一次做時(shí)先跑一個(gè)濃度梯度0.5、1、2、5 μg/mL四個(gè)濃度看哪個(gè)濃度下信噪比最理想。這個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)千萬(wàn)別偷懶。我最初用肌管細(xì)胞時(shí)直接用了推薦濃度結(jié)果圖像亮得刺眼但背景也不低后來(lái)把濃度降到1 μg/mL把孵育時(shí)間從30分鐘延長(zhǎng)到1小時(shí)信號(hào)依然很強(qiáng)背景卻干凈了很多。高濃度不一定帶來(lái)更好的結(jié)果關(guān)鍵是找到特異信號(hào)和非特異吸附之間的平衡點(diǎn)。3.2 活細(xì)胞標(biāo)記步驟活細(xì)胞染色比固定染色更能反映受體在細(xì)胞表面的真實(shí)分布尤其在研究受體聚集、內(nèi)化或膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)幾乎是必需的。以貼壁培養(yǎng)細(xì)胞為例我的標(biāo)準(zhǔn)流程是先把細(xì)胞接種在玻璃底培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至70%~80%密度棄掉培養(yǎng)基后用預(yù)溫的HBSS或PBS洗兩次洗掉殘留血清因?yàn)檠宓鞍讜?huì)跟染料結(jié)合增加背景。染液的配制用無(wú)血清培養(yǎng)基或HBSS把AF350標(biāo)記毒素稀釋到工作濃度。孵育條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇4℃孵育1小時(shí)可以最大限度減少受體內(nèi)吞保留膜表面信號(hào)37℃孵育30分鐘信號(hào)更均勻但部分受體會(huì)被內(nèi)化。如果研究目標(biāo)是追蹤受體從膜表面到胞內(nèi)的過(guò)程那么37℃孵育后立即換液、按時(shí)間點(diǎn)成像就能記錄內(nèi)吞動(dòng)態(tài)如果只是想看膜表面受體分布4℃方案更穩(wěn)。孵育結(jié)束后洗3次每次5分鐘。洗滌很重要但也不要過(guò)于劇烈否則細(xì)胞容易從培養(yǎng)皿上飄起來(lái)。隨后換成不含酚紅的成像緩沖液采集圖像因?yàn)榉蛹t在紫外-藍(lán)光激發(fā)下有干擾。整個(gè)過(guò)程盡量避光、快速AF350雖然比很多藍(lán)光染料耐受一些但紫外激發(fā)的光漂白和光毒性還是明顯操作要干凈利落。3.3 固定細(xì)胞與組織切片染色如果不需要觀察活細(xì)胞動(dòng)態(tài)或者要做多輪染色的復(fù)雜標(biāo)記固定標(biāo)本更方便。貼壁細(xì)胞用4% PFA室溫固定15~20分鐘即可然后用PBS洗3次。多數(shù)研究nAChR的切片染色并不需要透化因?yàn)槭荏w位于膜表面毒素能直接接觸但如果你還想同時(shí)染胞內(nèi)蛋白那就需要用含0.1%~0.3% Triton X-100的PBS透化10分鐘。這一步要謹(jǐn)慎透化會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致部分膜表面信號(hào)變?nèi)?。封閉后用稀釋好的探針?lè)跤?℃過(guò)夜或室溫2小時(shí)。對(duì)組織切片比如神經(jīng)肌肉接頭標(biāo)本α-Bungarotoxin的優(yōu)勢(shì)極其明顯。以小鼠膈肌鋪片為例固定后直接加1 μg/mL探針染1小時(shí)清洗后就能看到終板區(qū)域一條條清晰的亮帶。整個(gè)肌肉鋪片厚度有限8 kDa的毒素分子可以輕松滲透甚至不需要透化處理。如果是厚度較大的腦片可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間到4℃過(guò)夜以獲得更均勻的滲透。3.4 成像參數(shù)與多色搭配建議AF350的成像參數(shù)激發(fā)濾片選330~385 nm窄帶發(fā)射濾片用420~480 nm普通DAPI通道就能覆蓋。曝光時(shí)間我習(xí)慣從50 ms開(kāi)始根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度逐步調(diào)整不要一上來(lái)就拉滿否則背景和自發(fā)熒光會(huì)一起放大。如果使用寬場(chǎng)顯微鏡紫外激發(fā)下的組織自發(fā)熒光可能比較明顯可以嘗試開(kāi)2×2 binning犧牲一點(diǎn)分辨率換取更高的信噪比。多色搭配是很容易踩坑的環(huán)節(jié)。比較穩(wěn)妥的組合是AF350藍(lán) GFP綠 遠(yuǎn)紅染料近紅外三種顏色在光譜上分得很開(kāi)。如果同時(shí)想染細(xì)胞核不要用DAPI因?yàn)镈API和AF350的發(fā)射光譜重疊兩者在同一個(gè)藍(lán)色通道里根本無(wú)法區(qū)分?？梢愿挠眉t色或遠(yuǎn)紅核染料比如PI、DRAG5或TO-PRO-3把核信息挪到紅色通道里。還有一點(diǎn)在做三色成像前最好用單色標(biāo)記樣品確認(rèn)每個(gè)通道沒(méi)有串色。特別是綠色熒光蛋白在紫外激發(fā)下也可能產(chǎn)生少量信號(hào)如果你發(fā)現(xiàn)藍(lán)色通道里隱約出現(xiàn)了GFP陽(yáng)性細(xì)胞的輪廓大概率不是AF350串色而是紫外光直接激發(fā)了GFP。這時(shí)候可以縮小激發(fā)帶寬或換一個(gè)更窄的發(fā)射濾塊。3.5 對(duì)照組設(shè)計(jì)與定量扣除nAChR染色最常見(jiàn)的問(wèn)題不是“染不上”而是“染色不特異”。α-Bungarotoxin對(duì)受體親和力很高但在高濃度時(shí)也可能有較弱的非特異吸附組織標(biāo)本中還存在其他能跟毒素發(fā)生弱結(jié)合的組分。最經(jīng)典的驗(yàn)證方法是競(jìng)爭(zhēng)阻斷實(shí)驗(yàn)用100倍摩爾比以上的未標(biāo)記α-Bungarotoxin先孵育標(biāo)本30分鐘再加入AF350標(biāo)記探針。如果信號(hào)被顯著抑制說(shuō)明標(biāo)記探針和未標(biāo)記毒素競(jìng)爭(zhēng)的是同一類位點(diǎn)也就是真正的nAChR。這個(gè)對(duì)照應(yīng)該在每種新標(biāo)本上重復(fù)。我曾經(jīng)為了省事漏掉對(duì)照組結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)組織信號(hào)怎么都消不掉后來(lái)做了競(jìng)爭(zhēng)阻斷才發(fā)現(xiàn)那是一處非特異沉積。做定量分析時(shí)競(jìng)爭(zhēng)組的殘余信號(hào)可以作為背景值扣除。用ImageJ做受體密度測(cè)定時(shí)我會(huì)在同樣條件下拍實(shí)驗(yàn)組和競(jìng)爭(zhēng)組的圖像對(duì)競(jìng)爭(zhēng)組取平均灰度作為背景再在實(shí)驗(yàn)組灰度中扣除這個(gè)值得到的相對(duì)密度就更接近真實(shí)情況。4. 常見(jiàn)問(wèn)題與排查技巧實(shí)錄4.1 信號(hào)弱先查濃度、孵育時(shí)間和光路別急著換產(chǎn)品信號(hào)弱的原因多數(shù)出在工作濃度太低或孵育時(shí)間太短。以1 μg/mL、4℃ 1小時(shí)為例對(duì)高表達(dá)受體的肌管細(xì)胞通常足夠亮但遇到低豐度受體比如腦片上的α7 nAChR可能要把濃度提高到5 μg/mL孵育時(shí)間延長(zhǎng)到2~4小時(shí)甚至4℃過(guò)夜。遇到這類情況我建議先做一個(gè)簡(jiǎn)單的劑量梯度不要跳步。還要檢查顯微鏡光路。紫外激發(fā)光在經(jīng)過(guò)濾塊、物鏡和鏡組后的損耗相當(dāng)大如果用的還是一盞用了多年的汞燈信號(hào)衰減會(huì)非常明顯。優(yōu)先用LED光源或共聚焦的紫外激光線重新校正光路或者換一塊透光效率更好的紫外濾塊往往比加濃度更有效。4.2 背景高洗滌、封閉和自發(fā)熒光逐一排查背景高通常有幾種來(lái)源?；罴?xì)胞染色時(shí)背景可能來(lái)自殘留血清與非特異蛋白的結(jié)合這就是為什么染液要用無(wú)血清培養(yǎng)基配、且在染色前把細(xì)胞洗兩遍。固定組織背景可能來(lái)自自發(fā)熒光尤其是血管壁、紅細(xì)胞和膠原纖維在紫外激發(fā)下有較強(qiáng)的本底這在肌肉組織和腦片中很常見(jiàn)。處理策略增加洗滌次數(shù)和延長(zhǎng)洗滌時(shí)間固定標(biāo)本可嘗試在洗滌液中加入0.1% Tween-20染液稀釋液中加入1% BSA可以降低非特異吸附。對(duì)于頑固的自發(fā)熒光還可以考慮用硼氫化鈉還原處理后固定切片以減少醛類交聯(lián)產(chǎn)生的熒光但這個(gè)方法對(duì)某些熒光蛋白信號(hào)可能產(chǎn)生影響要在自己的體系里先驗(yàn)證。4.3 熒光信號(hào)逐漸衰減注意保存和避光如果整個(gè)批次都在變暗多半是探針保存出了問(wèn)題。AF350-α-Bungarotoxin要分裝后-20℃避光保存避免反復(fù)凍融。凍融次數(shù)多了偶聯(lián)物可能降解或聚集表現(xiàn)在染色上就是信號(hào)越來(lái)越弱。另外染好的切片如果不馬上拍照盡量保存在4℃避光環(huán)境中封片得當(dāng)?shù)脑捒梢苑€(wěn)定數(shù)周但別指望長(zhǎng)期保存后信號(hào)和新鮮染色完全一樣。活細(xì)胞成像時(shí)還要注意采集速度。紫外光反復(fù)打在同一個(gè)區(qū)域熒光衰減會(huì)很快。設(shè)計(jì)時(shí)間序列實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量縮短曝光時(shí)間或者降低激發(fā)光強(qiáng)度寧可幀間間隔長(zhǎng)一點(diǎn)也不要讓每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)都在快速下降。4.4 多色干擾從光源、濾塊和標(biāo)記方案三處入手多色成像中你會(huì)發(fā)現(xiàn)藍(lán)色通道里出現(xiàn)綠色細(xì)胞的輪廓這大概率不是AF350的串色而是紫外激發(fā)光直接激發(fā)了綠色熒光蛋白。解決方式有三種減小激發(fā)光帶寬、使用更窄的發(fā)射濾塊或者引入光譜拆分功能。如果你的顯微鏡沒(méi)有光譜拆分最簡(jiǎn)單的方法是把綠色熒光蛋白的激發(fā)濾塊盡量避開(kāi)紫外波段或者換用更特異性的綠色染料。還有一個(gè)組合性問(wèn)題是AF350與DAPI沖突前面已經(jīng)強(qiáng)調(diào)過(guò)。我的經(jīng)驗(yàn)是“一個(gè)視野里藍(lán)色通道只留給AF350”這條原則要嚴(yán)格執(zhí)行寧可多花點(diǎn)時(shí)間把核染到紅色通道也不要讓藍(lán)色通道同時(shí)承載兩種信號(hào)否則后面定量時(shí)光譜拆分會(huì)很讓人頭疼。下表是我常用來(lái)排錯(cuò)的一個(gè)速查思路?，F(xiàn)象可能原因優(yōu)先檢查項(xiàng)特異性信號(hào)弱濃度低、時(shí)間短、光路效率下降做濃度梯度、檢查紫外濾塊與光源背景整體偏高血清殘留、封閉不足、自發(fā)熒光充分洗滌、加BSA、增加封閉時(shí)間藍(lán)通道出現(xiàn)綠色輪廓紫外光激發(fā)GFP換窄帶濾塊或做單通道預(yù)檢信號(hào)隨批次下降F/P差異、保存不當(dāng)查看COA、分裝避光保存藍(lán)通道核信號(hào)過(guò)強(qiáng)DAPI與AF350光譜重疊換紅色/遠(yuǎn)紅核染料4.5 安全操作提醒再溫和也是毒蛋白雖然商品化熒光探針的使用濃度極低但α-Bungarotoxin本質(zhì)上是神經(jīng)毒素。操作時(shí)建議戴雙層手套在通風(fēng)櫥內(nèi)稀釋避免氣溶膠和皮膚接觸。用過(guò)的染液、洗滌液和廢液都按有毒廢物統(tǒng)一處理?；罴?xì)胞染色尤其注意液體可能濺出操作臺(tái)墊上一次性吸水紙會(huì)穩(wěn)妥很多。我實(shí)驗(yàn)室的規(guī)矩是每次用完在冰箱門上登記領(lǐng)用量和剩余量這樣既清楚庫(kù)存也方便廢棄物流轉(zhuǎn)溯源。雖然是件小事但在實(shí)際管理里幫了不少忙。5. 應(yīng)用場(chǎng)景從神經(jīng)肌肉接頭到受體動(dòng)態(tài)篩選5.1 神經(jīng)肌肉接頭研究最經(jīng)典的主場(chǎng)AF350-α-Bungarotoxin最經(jīng)典、最成熟的應(yīng)用方向就是神經(jīng)肌肉接頭NMJ的形態(tài)與功能研究。神經(jīng)肌肉接頭是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢與骨骼肌纖維之間的突觸突觸后膜上聚集著極高密度的肌肉型nAChR這些受體在終板區(qū)域形成特征性的彎曲突起。用標(biāo)記毒素染色后可以非常直觀地看到受體的分布形態(tài)研究去神經(jīng)支配后的受體變化、神經(jīng)再支配時(shí)的受體聚集以及agrin/LRP4/MuSK信號(hào)通路對(duì)受體聚簇的調(diào)控。做肌纖維染色時(shí)整塊肌肉鋪片后染色是最常見(jiàn)的方案。我習(xí)慣把肌肉固定在稍微拉伸的狀態(tài)下避免收縮導(dǎo)致受體形態(tài)變形。染色后發(fā)現(xiàn)終板信號(hào)呈現(xiàn)“弧形亮帶”或“假性皺褶”樣結(jié)構(gòu)說(shuō)明受體聚集成熟如果信號(hào)彌散、亮帶不連續(xù)通常提示受體聚集受阻。這種形態(tài)學(xué)判斷做起來(lái)很快信息量卻很大。5.2 中樞與外周α7受體的定位α7型nAChR在海馬、皮層等腦區(qū)有表達(dá)也是很多藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。用AF350-α-Bungarotoxin可以對(duì)這些受體進(jìn)行組織化學(xué)定位比如標(biāo)記腦片中α7陽(yáng)性區(qū)域。但要注意α7受體的表達(dá)密度通常比肌肉型受體低很多染色條件需要更強(qiáng)我把濃度提到2~5 μg/mL4℃孵育過(guò)夜并且建議用高靈敏的相機(jī)或共聚焦系統(tǒng)采集圖像否則容易出現(xiàn)“感覺(jué)像沒(méi)染上”的結(jié)果。不過(guò)也需要提醒的是α-Bungarotoxin在中樞組織中對(duì)α7受體有較高親和力但并不僅僅結(jié)合α7如果標(biāo)本里混有其他能跟毒素起反應(yīng)的亞基信號(hào)解讀要謹(jǐn)慎。最好還是配上α7特異性抗體做共定位驗(yàn)證或者用α7基因缺失的組織做陰性對(duì)照。5.3 受體膜動(dòng)態(tài)追蹤活細(xì)胞里的時(shí)間軸活細(xì)胞體系中AF350-α-Bungarotoxin的另一個(gè)有趣應(yīng)用是追蹤受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)。先4℃標(biāo)記膜表面受體把探針“凍”在膜上然后升高溫度并啟動(dòng)時(shí)間序列成像就能看到標(biāo)記受體被內(nèi)吞、進(jìn)入囊泡并運(yùn)動(dòng)的過(guò)程。如果同時(shí)標(biāo)記早期內(nèi)體或溶酶體可以重建受體從膜表面到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)軌跡。這種實(shí)驗(yàn)有幾個(gè)細(xì)節(jié)。第一4℃標(biāo)記完后要充分洗滌避免游離探針在升溫后繼續(xù)結(jié)合并干擾信號(hào)第二升溫到37℃后動(dòng)作要快盡早開(kāi)始采集因?yàn)榈谝慌鷥?nèi)吞事件往往在幾分鐘內(nèi)就發(fā)生第三紫外激發(fā)光對(duì)細(xì)胞有光毒性長(zhǎng)時(shí)間追蹤時(shí)盡量縮短每幀曝光時(shí)間用更低的激光功率和更大步長(zhǎng)的時(shí)間間隔來(lái)?yè)Q取細(xì)胞活性。5.4 定量篩選與流式分析AF350-α-Bungarotoxin還可以配合流式細(xì)胞術(shù)做nAChR表達(dá)水平的半定量檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記、洗滌后上機(jī)藍(lán)色通道的平均熒光強(qiáng)度反映受體表達(dá)水平的相對(duì)高低。比起Western blot需要裂解細(xì)胞且無(wú)法區(qū)分細(xì)胞表面與胞內(nèi)受體流式的優(yōu)勢(shì)在于可以直接定量細(xì)胞表面功能性受體的數(shù)量。在做藥物篩選時(shí)可以用標(biāo)記毒素的結(jié)合強(qiáng)度作為讀出信號(hào)觀察藥物處理對(duì)受體表達(dá)和膜定位的影響。輸出指標(biāo)可以取平均熒光強(qiáng)度或者陽(yáng)性細(xì)胞比例。需要注意的是流式細(xì)胞術(shù)的紫外激光配置不是所有機(jī)器都有用之前先確認(rèn)機(jī)器支持藍(lán)色熒光檢測(cè)通道如果沒(méi)有紫外激光只能改用其他熒光標(biāo)記版本的α-Bungarotoxin設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)要提前確認(rèn)。5.5 個(gè)人實(shí)操體會(huì)與幾個(gè)容易被忽略的細(xì)節(jié)做這類受體探針實(shí)驗(yàn)這幾年我最深的感受是這工具的關(guān)鍵不在把毒素染上去而在于把“非特異”和“特異性”分開(kāi)。每個(gè)新系統(tǒng)、新細(xì)胞系、新組織類型都要花10分鐘做一次競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照和濃度梯度省掉的這一步往往會(huì)在后面變成幾個(gè)小時(shí)都解釋不了的數(shù)據(jù)。另外還有三個(gè)細(xì)節(jié)容易被忽略。一是做定量比較時(shí)務(wù)必保持同一批號(hào)產(chǎn)品和完全一致的成像參數(shù)否則不同批次的F/P差異會(huì)直接影響信號(hào)強(qiáng)度二是藍(lán)色波段的成像對(duì)光路潔凈度要求很高物鏡和濾塊上的一點(diǎn)灰塵就會(huì)被紫外光放大定期清潔光學(xué)元件能明顯改善信噪比三是新的實(shí)驗(yàn)人員上手前最好先拿已知高表達(dá)的神經(jīng)肌肉接頭標(biāo)本練一次手熟悉了“應(yīng)該多亮”的標(biāo)準(zhǔn)再去做真正表達(dá)量偏低的樣本時(shí)會(huì)少走很多彎路。